Cvičenia pre biológov: Fylogenetické stromy

• Praktická ukážka tvorby stromov
  • Viacnásobné zarovnania z UCSC browsera
  • Strom metódou spájania susedov
  • Stromy na Galaxy

Praktická ukážka tvorby stromov

Viacnásobné zarovnania z UCSC browsera

• V UCSC browseri môžeme získavať viacnásobné zarovnania jednotlivých génov (nukleotidy alebo proteíny). Nasledujúci postup nemusíte robiť, súbor je nižšie
  • V UCSC browseri si pozrieme úsek ľudského genómu (verzia hg38) chr6:135,851,998-136,191,840 s génom PDE7B (phosphodiesterase 7B)
  • Na modrej lište zvolíme Tools, Table browser. V nastaveniach tabuliek Group: Genes and Gene Predictions, Track: All GENCODE v 49., zaklikneme Region: position, a Output format: CDS FASTA alignment a stlačíme Get output
  • Na ďalšej obrazovke zaklikneme show nucleotides, zvolíme MAF table multiz100way a vyberieme si, ktoré organizmy chceme. V našom prípade z primátov zvolíme chimp, rhesus, bushbaby, z iných cicavcov mouse, rat, rabbit, pig, cow, dog, elephant a z ďalších organizmov opposum, platypus, chicken, stlačíme Get output.
  • Výstup uložíme do súboru, necháme si iba prvú formu génu (ENST00000308191.11_hg38), z mien sekvencií zmažeme spoločný začiatok (ENST00000308191.11_hg38) a celkovo prepíšeme skratky druhov na anglické názvy.
  • Výsledné zarovnanie
  • Podobný postup sme ešte spravili s génom EFL1, transkript ENST00000891314.1, výsledné zarovnanie

Strom metódou spájania susedov

• So zarovnaniami vyššie skúsme zostaviť strom na stránke https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/phylogeny/simple_phylogeny
  • Distance correction: ako na prednáške, z počtu pozorovaných mutácií na evolučný čas - zapneme
  • Exclude gaps: vynechať všetky stĺpce s pomlčkami - radšej nie
  • Clustering method: UPGMA predpokladá molekulárne hodiny, spájanie susedov nie
  • P.I.M. vypíš aj maticu vzdialeností (% identity, pred korekciou)
  • Vo výslednom strome by sme mali zmeniť zakorenenie, aby sme mali sliepku (chicken) ako outgroup (kliknutím na sliepku a voľbou v menu)
• Výsledky pre prvé zarovnanie z programu https://www.phylogeny.fr/alacarte.cgi , ktorý podporuje aj bootstrap:
  • Výsledok s pôvodným zakorenením
  • Výsledok so správnym zakorenením (chicken = outgroup)
• “Správny strom” v nastaveniach Conservation track-u v UCSC browseri podľa článku Murphy WJ et al Resolution of the early placental mammal radiation using Bayesian phylogenetics. Science 2001
• Náš strom má dosť zlých hrán: zlé postavenie hlodavcov, ale aj slona a psa. Zlé postavenie hlodavcov môže byť spôsobené long branch attraction.
• Ak chcete skúsiť zostaviť aj zarovnania, treba začať z nezarovnaných sekvencií

Zostavili sme strom aj IQ-TREE pomocou metódy maximálnej vierohodnosti na Galaxy, viď nižšie

• modely v IQ-TREE
• výsledok
• na strom v newickovom formáte (zátvorky) použijeme vizualizáciu stromov, napr. https://phylotree.hyphy.org/ aby sme ho mohli správne zakoreniť

Stromy na Galaxy

Webstránka s veľa nástrojmi https://usegalaxy.eu/

• Obsahuje veľa bioinformatických nástrojov, ktoré môžete spúšťať
• Ale na výsledky treba niekedy dlho čakať
• V ľavom stĺpci hľadanie nástroja alebo nahrávanie dát
• V pravom stĺpci zoznam nahratých dát, bežiacich programov a hotových výsledkov (výsledky si pozriete ikonou oka alebo stiahnete ikonou diskety)
• V strede nastavenia nástroja alebo prezeranie výsledkov
• Pri serióznom používaní odporúčam vytvoriť si konto a prihlásiť sa

Pre ďalšie pokusy: nezarovnané sekvencie proteínov z rôznych organizmov:

• Sekvencie
• Nájdené pomocou BLAST v Uniprote ako homológy proteínu YCF1 z S. cerevisiae
• Zarovnáme na Galaxy pomocou muscle, strom spravíme cez rapidnj alebo IQ-tree
• Dáta nahráme ikonou Upload úplne vľavo hore, v dolnom rade tlačidiel treba dať Paste/Fetch data
• Strom zobrazíme ikonkou grafu alebo cez phylotree.
• Predpočítané výsledky