Skórovacie matice

Chceme určiť skórovaciu schému pre zarovnávanie dvoch DNA sekvencií (bez medzier). Máme dva modely, každý z nich vie vygenerovať 2 zarovnané sekvencie dĺžky n.

Model R (random) reprezentuje nezávislé náhodne sekvencie

  • Použijeme naše vrece s guličkami označenými A,C,G,T, pričom guličiek označených A je 30%, C 20%, G 20% a T 30%.
  • Vytiahneme guličku, zapíšeme si písmeno, hodíme ju naspäť, zamiešame a opakujeme s ďalším písmenom atď až kým nevygenerujeme n písmen pre jednu sekvenciu a n písmen pre druhú
  • Máme jednu sekvenciu ACT a druhú ACC. Aká je pravdepodobnosť, že práve tieto sekvencie vygenerujeme v našom modeli R?
  • Nezávislé udalosti pre jednotlivé písmená, t.j. $\Pr(X1=A)\cdot \Pr(X2=C)\cdot \Pr(X3=T) \cdot \Pr(Y1=A) \cdot \Pr(Y2=C)\cdot \Pr(Y3=C)$
  • Po dosadení dostaneme $0,3\cdot 0,2\cdot 0,3\cdot 0,3\cdot 0,2\cdot 0,2 = 0,000216$
  • Spolu máme v modeli $4^6 = 4096$ možností ako vygenerovať dve DNA sekvencie dĺžky 3

Model H (homolog) reprezentuje zarovnanie vzájomne súvisiacich sekvencií

  • máme vrece, v ktorom je napr.
    • po 21% guličiek označených AA, TT
    • po 14% označených CC, GG
    • po 2,4% označených AC, AG, CA, CT, GA, GT, TC, TG
    • po 3,6% označených AT, TA
    • po 1,6% označených CG, GC.
  • Spolu máme 70% guličiek označených rovnakými písmenami, 30% rôznymi
  • n krát z vreca vytiahneme guličku a písmená píšeme ako stĺpce zarovnania $A_1, A_2,\dots, A_n$.
  • aká je pravdepodobnosť, ze dostaneme ACT zarovnané s ACC?
  • $\Pr(A_1=AA)\cdot \Pr(A_2=CC)\cdot \Pr(A_3=TC) = 0,21\cdot 0,14\cdot 0,024 = 0,0007056$

Skóre zarovnania je log Pr(zarovnania v H)/Pr(zarovnania v R), t.j. log (0,0007056 / 0,000216) = 0,514105 (pre desiatkový logaritmus)

  • kladné skóre znamená, že model H lepšie zodpovedá dátam (zarovnaniu) ako model R
  • záporné skóre znamená, že model R lepšie zodpovedá dátam

Cvičenie pri počítači

  • Stiahnite si súbor nižšie, uložte si ho a otvorte v Exceli / OpenOffice / LibreOffice
  • V záložke Matica vyplňte do žltej oblasti vzorce na výpočet pravdepodobnosti krátkeho zarovnania, logaritmus pomeru pravdepodobnosti a súčet skóre, pričom vo vzorcoch použijete odkazy na políčka v riadkoch 9-13, stĺpcoch B a E

  • Súčet skóre by mal byť zhruba rovný desaťnásobku logaritmu pomeru - prečo vidíme rozdiely?

  • Potom skúšajte meniť %GC a %identity v horných riadkoch tabuľky a pozrite sa, ako to ovplyvní skórovanie. Výsledné skóre zo stĺpca E ručne prepíšte (bez formúl) do tabuľky v záložke Výsledky. Prečo nastávajú také zmeny ako vidíte?

Praktické cvičenie pri počítači: dotploty

Yass a dotploty

  • Program Yass hľadá lokálne zarovnania v sekvenciách DNA, zobrazuje ich vo forme dot plotov
  • V novom okne/tabe si otvorte YASS server na adrese https://bioinfo.univ-lille.fr/yass/yass.php
  • V ďalšom okne si na stránke UCSC genome browseru si zobrazte oblast chr21:9,180,027-9,180,345 vo verzii hg38 ľudského genómu
    • tento región obsahuje Alu repeat. Tieto opakovania tvoria cca 10% ľudského genómu, viac ako milión kópií
    • zobrazte si sekvenciu tohto úseku DNA takto: na hornej modrej lište zvoľte View, potom v podmenu DNA, na ďalšej obrazovke tlačidlo get DNA
  • DNA sekvenciu Alu opakovania chceme zarovnať samu k sebe programom YASS
    • DNA sekvenciu Alu opakovania skopírujte do okienka “Paste your sequences” v stránke Yass-u a dvakrát stlačte tlačidlo Select vedľa okienka
    • Nižšie v časti Selected DNA sequence(s) by sa vám malo v oboch riadkoch objaviť Pasted file 1
    • Nižšie v časti Parameters zvoľte E-value threshold 0.01 a stlačte “Run YASS”
    • Vo výsledkoch si pozrite Dotplot, čo z neho viete usúdiť o podobnosti jednotlivých častí Alu opakovania?
    • Vo výsledkoch si pozrite Raw: blast, aké sú súradnice opakujúcej sa časti a koľko zarovnanie obsahuje zhod/nezhod/medzier? (Pozor, prvé zarovnanie je celá sekvencia sama k sebe, druhé je asi to, čo chcete)
  • V genome browseri sa presuňte na pozíciu chr21:8,552,000-8,562,000 (10kb na chromozóme 21, s niekoľkými výskytmi Alu)
  • Chceme teraz porovnať tento úsek genómu so sekvenciou Alu pomocou YASSu
    • Ako predtým si stiahnite DNA sekvenciu tohto úseku
    • V YASSe choďte šípkou späť na formulár
    • Skopírujte DNA sekvenciu do okienka vpravo (vyznačiť si ju môžete klávesovou kombináciou Ctrl-A alebo Select All v menu Edit),
    • V časti formulára Selected DNA sequence(s) stlačte Remove pri hornom riadku
    • Pri pravom okienku, kam ste nakopírovali sekvenciu, stlačte Select
    • Zase stlačte Run YASS
    • Pozrite si výsledok ako Dotplot, ‘'’koľko opakovaní Alu ste našli? Prečo je jedno červené? ‘’’
    • Pozrite si Raw: blast, na koľko percent sa podobá najpodobnejšia a na koľko druhá najpodobnejšia kópia?

Dotplot celých kvasinových genómov

Príklady praktických programov

Pozrime sa na niekoľko nástrojov, všimnime si, aké poskytujú nastavenia a čo vypisujú na výstupe, dajme to do súvisu s prednáškami

Plné dynamické programovanie

  • Balíček emboss, obsahuje programy na klasické dynamické programovanie (needle - globálne, water - lokálne), nájdu sa na stránke EBI https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa
  • porovnanie lokálneho a globálneho zarovnania
    • Dva proteiny z rôznych kvasiniek zarovnáme lokálne, globálne a globálne s tým, že neplatíme za medzery na koncoch
  • sekvencie a výsledné zarovnania
  • vo výsledku si všimnime, koľko má každé z nich %identity, %gaps, a kam sa zarovna sekvencia IRESPLGG ktorá je na pozícii 29 v prvom a 30 v druhom proteíne
    Lokálne zarovnanie
    Length: 588
    Identity:     170/588 (28.9%)
    Similarity:   270/588 (45.9%)
    Gaps:         116/588 (19.7%)
    Score:  611.0
    MCA_00027_1 29-568 (z 595)
    RKM3_YEAST  30-549 (z 552)
    
    Globálne zarovnanie
    Length: 650
    Identity:     178/650 (27.4%)
    Similarity:   282/650 (43.4%)
    Gaps:         153/650 (23.5%)
    Score: 588.5

NCBI Blast

  • NCBI BLAST https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ veľa rôznych nástrojov (porovnavanie DNA aj proteínov, prípadne translácia DNA na proteín v 6 rámcoch)
    • Heuristický algoritmus, môže niektoré zarovnania vynechať
    • rôzne nastavenia, výstup E-value

Low complexity masking: nepoužívať pri hľadaní jadier zarovnania regiony, v ktorých sa veľakrát opakuje tá istá aminokyselina

  • Príklad (z učebnice Zvelebil and Baum):
    >sp|P04156|PRIO_HUMAN Major prion protein OS=Homo sapiens GN=PRNP PE=1 SV=1
    MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQP
    HGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGA
    VVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCV
    NITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPV
    ILLISFLIFLIVG
  • Hľadajme v databáze Reference proteins (refseq_protein), organizmus human, vypneme Compositional adjustment (len kvôli tomuto príkladu) aj Masking a Filtering.

BLAST vypíše napr. aj toto zarovnanie:

keratin, type I cytoskeletal 9 [Homo sapiens]
Sequence ID: NP_000217.2
Range 1: 498 to 602
Score	          Expect	Identities	Positives	  Gaps
62.0 bits(149)	4e-10	  40/105(38%)	49/105(46%)	6/105(5%)
Query  29   GGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGG----GGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQP  84
            GG  +GG    G GS GG+     GG    GG G  +GGG G  H GG G  H GG G  
Sbjct  498  GGGGSGGGYGGGSGSRGGSGGSYGGGSGSGGGSGGGYGGGSGGGHSGGSGGGHSGGSGGN  557

Query  85   HGGGWGQGGGTHSQW--NKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGG  127
            +GGG G GGG+   +     S+  +   H  G+   G   G  GG
Sbjct  558  YGGGSGSGGGSGGGYGGGSGSRGGSGGSHGGGSGFGGESGGSYGG  602

Ak zapneme maskovanie, toto zarovnanie už nenájde, v zarovnaní samého so sebou sa objavia malé písmená alebo X:

    >ref|NP_000302.1|major prion protein preproprotein [Homo sapiens]
    Length=253
    
     Score =   520 bits (1340),  Expect = 0.0, Method: Compositional matrix adjust.
     Identities = 253/253 (100%), Positives = 253/253 (100%), Gaps = 0/253 (0%)
    
    Query  1    MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYppqggggwgqp  60
                MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQP
    Sbjct  1    MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQP  60
    
    Query  61   hgggwgqphgggwgqphgggwgqphgggwgqgggTHSQWNKPSKPKTNMKHMagaaaaga  120
                HGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGA
    Sbjct  61   HGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGA  120
    
    Query  121  vvgglggymlgsamsRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCV  180
                VVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCV
    Sbjct  121  VVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCV  180
    
    Query  181  NITIKQHtvttttkgenftetDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSsppv  240
                NITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPV
    Sbjct  181  NITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPV  240
    
    Query  241  illisfliflivG  253
                ILLISFLIFLIVG
    Sbjct  241  ILLISFLIFLIVG  253

Praktické cvičenie pri počítači: BLAT vs BLAST

BLAT, chains, nets v UCSC browseri

  • Program BLAT v UCSC browseri https://genome-euro.ucsc.edu/ rýchlo vyhľadáva sekvencie v genóme, ale nevie nájsť slabšie podobnosti
    • Vhodné použitie: zarovnanie mRNA ku genómu, presné určenie súradníc nejakej sekvencie, a pod.
  • Net tracky v UCSC genome browseri (predpočítané zarovnania) nám umožňujú prechádzať medzi homologickými oblasťami rôznych genómov

BLAT/BLAST

  • Sekvencia uvedena nižšie vznikla pomocou RT-PCR na ľudských cDNA knižniciach
  • Choďte na UCSC genome browser https://genome-euro.ucsc.edu/ , na modrej lište zvoľte BLAT, zadajte túto sekvenciu a hľadajte ju v ľudskom genóme. Akú podobnosť (IDENTITY) má najsilnejší nájdený výskyt? Aký dlhý úsek genómu zasahuje? (SPAN). Všimnite si, že ostatné výskyty sú oveľa kratšie.
  • V stĺpci ACTIONS si pomocou Details môžete pozrieť detaily zarovnania a pomocou Browser si pozrieť príslušný úsek genómu.
  • V tomto úseku genómu si zapnite track Vertebrate net na full a kliknutím na farebnú čiaru na obrázku pre tento track zistite, na ktorom chromozóme sliepky sa vyskytuje homologický úsek.
  • Skusme tu istu sekvenciu zarovnat ku genomu sliepky programom Blat: stlacte najprv na hornej modrej liste Genomes, zvolte Vertebrates a Chicken a potom na hornej liste BLAT. Do okienka zadajte tu istu sekvenciu. Akú podobnosť a dĺžku má najsilnejší nájdený výskyt teraz? Na ktorom je chromozóme?
  • Skúsme to isté v NCBI blaste: Choďte na https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ zvoľte nucleotide blast, database others a z menu reference genomic sequence, organism chicken (taxid:9031), program blastn
  • Aká je dĺžka, identity a E-value najlepšieho zarovnania? Na ktorom je chromozóme?

RT PCR sekvencia z cvičenia vyššie

AACCATGGGTATATACGACTCACTATAGGGGGATATCAGCTGGGATGGCAAATAATGATTTTATTTTGAC
TGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTCTTATAATGCCAACTTTGTACAAGAA
AGTTGGGCAGGTGTGTTTTTTGTCCTTCAGGTAGCCGAAGAGCATCTCCAGGCCCCCCTCCACCAGCTCC
GGCAGAGGCTTGGATAAAGGGTTGTGGGAAATGTGGAGCCCTTTGTCCATGGGATTCCAGGCGATCCTCA
CCAGTCTACACAGCAGGTGGAGTTCGCTCGGGAGGGTCTGGATGTCATTGTTGTTGAGGTTCAGCAGCTC
CAGGCTGGTGACCAGGCAAAGCGACCTCGGGAAGGAGTGGATGTTGTTGCCCTCTGCGATGAAGATCTGC
AGGCTGGCCAGGTGCTGGATGCTCTCAGCGATGTTTTCCAGGCGATTCGAGCCCACGTGCAAGAAAATCA
GTTCCTTCAGGGAGAACACACACATGGGGATGTGCGCGAAGAAGTTGTTGCTGAGGTTTAGCTTCCTCAG
TCTAGAGAGGTCGGCGAAGCATGCAGGGAGCTGGGACAGGCAGTTGTGCGACAAGCTCAGGACCTCCAGC
TTTCGGCACAAGCTCAGCTCGGCCGGCACCTCTGTCAGGCAGTTCATGTTGACAAACAGGACCTTGAGGC
ACTGTAGGAGGCTCACTTCTCTGGGCAGGCTCTTCAGGCGGTTCCCGCACAAGTTCAGGACCACGATCCG
GGTCAGTTTCCCCACCTCGGGGAGGGAGAACCCCGGAGCTGGTTGTGAGACAAATTGAGTTTCTGGACCC
CCGAAAAGCCCCCACAAAAAGCCG